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実験例 |
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１．ICONプローブは標的のメチルシトシンとのみオスミウム錯体形成
を行う |
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・ モデル標的ＤＮＡのＮはシトシン（Ｃ）もしくはメチルシトシン（Ｍ）
・ ＩＣＯＮプローブのＢは標的のメチルシトシンと錯体形成を行う
修飾ヌクレオチド
（Ａ）３２Ｐで５’末端を標識したＤＮＡに対し、ＩＣＯＮプローブ存在下で
オスミウム錯体形成反応を行ったサンプルを電気泳動した。
オスミウム錯体の形成によって生じた鎖間クロスリンク体が
泳動度の遅いバンドとして確認できる（矢印）。
（Ｂ）反応後のサンプルを加熱アルカリ処理を行い 電気泳動した。
泳動度の早いバンドが確認でき（矢印）、メチルシトシンにおいて
標的ＤＮＡとＩＣＯＮプローブが錯体形成によりクロスリンクしてい
たことが確認できる。 一番左のグアニン-アデニン塩基切断
Ｇ＋Ａレーンと比較することで、メチルシトシンの箇所で切断され
たことがわかる。
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２．ICONプローブを用いたメチル化DNAの配列選択的定量 |
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（ａ）定量的ＰＣＲ法によるＤＮＡ鎖間クロスリンク体の増幅阻害
非メチル化シトシン（点線）に比べ、メチル化シトシン（実線）はＩＣＯＮプローブ
とのＤＮＡ鎖間クロスリンク体の形成により、増幅の始まるサイクル数が遅れる。
（ｂ） （ａ）の曲線から作図したサンプル量の検量線
最初のメチル化ＤＮＡの量（モル数）に応じて、増幅開始のサイクル数（縦軸：
曲線の２次微分の極大値を用いた）が直線的に変化した。
（ｃ）メチル化量決定のための検量線
標的のシトシンのメチル化の割合に応じて、増幅開始のサイクル数（縦軸：
曲線の２次微分の極大値を用いた）が直線的に変化する。この方法を用い
れば、サンプル中のメチル化量を定量できる。
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３．メチル化の定量において同時に存在する他のメチル化領域には
影響されない |
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２ヶ所のメチル化部位（Ｃ１、Ｃ２）をもつ配列を含む仮想的ＤＮＡ２種類
（Ｃ１：メチル化・Ｃ２非メチル化とＣ１：非メチル化Ｃ２：メチル化）を一定の
割合で混合し、反応させた。横軸は混合系でのＣ１のメチル化率。
■はＣ１に対するプローブ、●はＣ２に対するプローブを用いた測定結果。
異なる２ヶ所のシトシンのメチル化の割合を変えても、標的のシトシンの
メチル化定量には影響されない。
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４．マウスゲノムの各組織におけるメチル化量の測定 |
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マウスの組織特異的なメチル化領域とされている２つのＣｐＧ配列に対して、
４種類の組織のゲノムサンプル（各２０ｎｇ）とＩＣＯＮプローブを用いてメチル化
率を測定した。
数値はメチル化率（％）
括弧内は５つの独立した実験から得られた標準偏差
この２つのメチル化サイトにおいて、異なる組織ごとに特徴的であるメチル化
レベルが確認された。 この結果は以前報告されたバイサルファイト処理を行
ったゲノムサンプルの質量分析によって得られたメチル化率の値に近い。
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実験例参考文献：Tanaka, K. et al.: J. Am. Chem. Soc., 129: 14511-14517, 2007 |