株式会社ジーンデザイン

		モデル実験プロトコール
		ICONプローブを用いたメチル化DNAの配列選択的定量実験（リアルタイムPCR使用） ※注意ここに記載してあるプロトコールは初期段階のモデルケースとしてのものです。各種溶液の濃度などは今後の検討により、さらに良い条件が出てくることが考えられます。あくまで参考としてご覧ください。
		反応
		・標的DNA溶液（100nM）　５μL ・ICONプローブミックス（センス鎖用・アンチセンス鎖用　各100nM）　５μL ・ヘキサシアノ鉄（Ⅲ）酸カリウム水溶液（1M）　５μL ・バッファーミックス（Tris-HCl（ｐH＝7.7　100mM）、EDTA（1mM）、　NaCl（2M））　２５μL これらを反応チューブ内で混合、95℃で5分加熱後、０℃に急冷 ↓ オスミウム酸カリウム水溶液（25mM）　１０μL を加え、55℃　1時間加熱 ↓ 脱塩処理を行い、そのろ液を後の実験に用いる
		定量
		脱塩したろ液をプライマー、ｄNTP、DNAポリメラーゼ、SYBR　GreenⅠ を含むPCR反応液に分注 ↓ リアルタイムPCRにて反応を行う（反応条件：　95℃　5秒　→　60℃　10秒　→　72℃　15秒）　×　50サイクル ↓ リアルタイム追跡（470nm励起/510nm検出）によって得られたデータを解析する
		検量線
		以上の反応を標準サンプル（メチル化0％、メチル化100％等）に対しても行い、それらの増幅曲線立ち上がり点から検量線を作成する。
		参考
		◆検量線用サンプルの作成方法１．目的配列を含む300base程度をPCRにて増幅し、精製を行う　　（PCRによりメチル化部分が非メチル化状態になったサンプルが　　増幅される）　　→メチル化０％サンプル２．１で得られたサンプルに対して、市販のメチル化キットを用いて　　メチル化処理を行う　　→メチル化１００％サンプル３．１と２を比率を変えて混合し、中間濃度サンプルとする。

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